Réactifs de coloration en microbiologie : Gram, May-Grünwald Giemsa et Ziehl-Neelsen

Pourquoi colorer les préparations microbiologiques ?

Les bactéries et cellules biologiques sont naturellement incolores et transparentes : elles ne peuvent pas être observées directement au microscope optique en fond clair. Les colorations permettent de les rendre visibles, de mettre en évidence leur morphologie et, pour les colorations différentielles, de les classer selon leurs propriétés de paroi. En hématologie, les colorations polychromes permettent de distinguer les différentes lignées cellulaires sanguines sur frottis.

La plupart des colorants utilisés en microbiologie sont des colorants ioniques : les colorants basiques (chargés positivement) se fixent aux acides nucléiques et aux parois bactériennes chargées négativement, tandis que les colorants acides colorent le cytoplasme et le fond. La compréhension de cette chimie permet de choisir et d'interpréter correctement chaque technique.

La coloration de Gram

Principe

La coloration de Gram (mise au point par Hans Christian Gram en 1884) est la technique de coloration la plus utilisée en bactériologie. Elle divise les bactéries en deux grands groupes selon la structure de leur paroi cellulaire :

• Bactéries Gram positif (Gram+) : paroi épaisse de peptidoglycane (20–80 nm) retenant le complexe violet de cristal-iode lors de la décoloration à l'alcool. Elles apparaissent violettes/bleues après coloration.
• Bactéries Gram négatif (Gram−) : paroi fine de peptidoglycane (2–7 nm) entourée d'une membrane externe lipopolysaccharidique. L'alcool solubilise cette membrane externe et le complexe violet est éliminé ; les bactéries prennent la safranine (contrecoloration) et apparaissent roses/rouges.

Protocole étape par étape

1. Préparation du frottis : étaler un film mince d'une colonie sur une lame dégraissée, laisser sécher à l'air, puis fixer à la flamme (3 passages rapides) ou à l'alcool méthylique (méthanol, 1 min) — la fixation à la flamme risque de dénaturer la morphologie ; la fixation méthanol est préférable.
2. Violet de cristal (1 min) : inonder la lame avec la solution de violet de cristal à 0,5–1 %. Rincer à l'eau distillée.
3. Lugol (1 min) : inonder avec la solution de Lugol (iode + iodure de potassium). Le complexe violet de cristal-iode se forme. Rincer à l'eau distillée.
4. Décoloration à l'alcool (15–30 secondes) : décolorer avec de l'éthanol à 95 % ou un mélange alcool-acétone jusqu'à ce que l'alcool s'écoule incolore des zones les plus épaisses du frottis. Rincer immédiatement à l'eau distillée. C'est l'étape critique : une décoloration excessive rend toutes les bactéries Gram−, une décoloration insuffisante les rend toutes Gram+.
5. Safranine (1 min) : contrecoloration avec la solution de safranine à 0,25–0,5 %. Rincer, égoutter, sécher doucement entre deux feuilles de papier absorbant.
6. Lecture au microscope à immersion (×1 000). Observer la morphologie (coques, bacilles, spirilles) et la disposition (amas, chaînettes, diplococcies).

Interprétation et exemples

• Cocci Gram+ en amas → Staphylococcus spp.
• Cocci Gram+ en chaînettes → Streptococcus spp.
• Diplocoques Gram+ en flamme de bougie → Streptococcus pneumoniae
• Bacilles Gram− fins → Entérobactéries (E. coli, Klebsiella, Salmonella...)
• Diplocoques Gram− intraleucocytaires → Neisseria gonorrhoeae
• Bacilles Gram+ sporulés → Bacillus ou Clostridium spp.

La coloration de May-Grünwald Giemsa (MGG)

Principe et applications

La coloration May-Grünwald Giemsa (MGG) est la technique de référence pour l'examen cytologique des frottis sanguins, des myélogrammes et des prélèvements cytologiques (LCR, liquide pleural, frottis cervico-vaginaux). Elle combine deux colorants :

• May-Grünwald : mélange d'éosine (acide, colore les structures basophiles en rouge-orange) et de bleu de méthylène (basique, colore les noyaux en bleu).
• Giemsa : mélange d'azur B, d'éosine et de bleu de méthylène. La combinaison produit des nuances de violet (azurophilie) caractéristiques des granulations et des noyaux.

Protocole MGG standard

1. Frottis sanguin : réaliser un frottis mince sur lame, laisser sécher à l'air (ne pas chauffer).
2. May-Grünwald pur (3 min) : inonder la lame avec la solution de May-Grünwald non diluée.
3. May-Grünwald dilué (1 min) : ajouter le même volume d'eau tamponnée pH 6,8 directement sur la lame sans rincer.
4. Rincer à l'eau tamponnée pH 6,8.
5. Giemsa dilué (10 à 20 min) : inonder avec la solution de Giemsa diluée au 1/10 dans l'eau tamponnée pH 6,8. La durée dépend de la fraîcheur du Giemsa et de l'épaisseur du frottis.
6. Rincer à l'eau tamponnée, sécher à l'air, monter sans couvrir ou sous couvercle avec baume synthétique.

Résultats attendus

• Globules rouges : rose saumon
• Noyaux des leucocytes : violet-rouge
• Neutrophiles : noyau multilobé violet, granulations lilacées fines
• Éosinophiles : granulations rouge-orangé vif
• Basophiles : granulations bleu-noir masquant le noyau
• Lymphocytes : noyau bleu foncé, cytoplasme bleu clair peu abondant
• Monocytes : noyau en haricot gris-violet, cytoplasme gris-bleu vacuolisé
• Plaquettes : petits amas violet-bleu

En parasitologie, la coloration MGG (et Giemsa seul) permet de visualiser les parasites intra-érythrocytaires du paludisme (Plasmodium spp.) : l'anneau intracytoplasmique et les granulations de Schüffner sont caractéristiques.

La coloration de Ziehl-Neelsen

Principe : les bactéries acido-alcoolo-résistantes (BAAR)

Les mycobactéries (Mycobacterium tuberculosis, M. avium, M. leprae...) possèdent une paroi riche en acides mycoliques qui les rend imperméables aux colorants classiques et résistantes à la décoloration par l'acide et l'alcool. La coloration de Ziehl-Neelsen exploite cette propriété : une fois colorées à la fuchsine carbolique à chaud, les BAAR ne se décolorent pas à l'acide chlorhydrique/alcool et restent roses/rouges, tandis que les autres bactéries et cellules prennent le bleu de méthylène (contrecoloration) et apparaissent bleues.

Protocole

1. Frottis : étaler l'expectoration ou le prélèvement sur lame, fixer à la flamme.
2. Fuchsine carbolique (5 min à chaud) : inonder la lame et chauffer doucement par le dessous jusqu'à émission de vapeurs (ne pas bouillir). Maintenir 5 min en chauffant par intermittence.
3. Rincer à l'eau distillée.
4. Décoloration acide : alcool chlorhydrique (HCl 3 % dans éthanol 95 %) pendant 3–5 min jusqu'à décoloration complète des zones non BAAR.
5. Rincer à l'eau distillée.
6. Bleu de méthylène (1 min) : contrecoloration. Rincer, sécher, lecture à l'objectif ×100 à immersion.

Interprétation et seuil de positivité

Les BAAR apparaissent comme des bâtonnets roses légèrement incurvés sur fond bleu. Le compte rendu semi-quantitatif (recommandations OMS/UICTMR) est :

• Négatif : aucun BAAR sur 300 champs
• Douteux : 1–9 BAAR sur 100 champs (à confirmer)
• 1+ : 10–99 BAAR sur 100 champs
• 2+ : 1–10 BAAR par champ (sur 50 champs)
• 3+ : > 10 BAAR par champ (sur 20 champs)

La sensibilité de la microscopie directe de Ziehl-Neelsen est de l'ordre de 10⁴–10⁵ bacilles/mL d'expectoration ; elle est complétée par la culture sur milieu de Löwenstein-Jensen et la PCR pour les cas suspects négatifs à l'examen direct.

Précautions de sécurité avec les réactifs de coloration

Plusieurs réactifs de coloration sont classés CMR (cancérigènes, mutagènes, reprotoxiques) ou nocifs :

• Violet de cristal : classé CMR catégorie 2 (suspect d'être cancérigène). Port de gants nitrile obligatoire, manipulation sous hotte aspirante.
• Fuchsine basique (coloration de Ziehl) : irritante, classée nocive. Éviter l'inhalation des vapeurs lors du chauffage.
• Alcool méthylique / méthanol (fixation et diluant) : toxique par inhalation, ingestion et contact cutané. Conserver en armoire ventilée.
• Lugol : corrosif en solution concentrée. Les solutions diluées utilisées en Gram sont peu dangereuses mais irritantes pour les yeux.

Toutes les lames colorées doivent être considérées comme des déchets biologiques à risque (DASRI — déchets d'activité de soins à risques infectieux) et éliminées dans les filières appropriées, notamment pour les frottis de tuberculose (Ziehl-Neelsen) qui peuvent contenir des bacilles viables.

Conserver les réactifs à l'abri de la lumière (les colorants photosensibles se dégradent rapidement), dans des flacons hermétiques à température ambiante ou selon les préconisations du fiche de données de sécurité (FDS). Vérifier systématiquement la date de péremption avant utilisation : un Giemsa dégradé donne des colorations pâles ou aberrantes.