Un microscope est un instrument qui permet d'obtenir une image agrandie d'objets de très petite dimension. Pour choisir un microscope, l’utilisateur doit identifier la taille de l’échantillon à étudier, déterminer le type d’observation que l’on souhaite faire, choisir le nombre d’oculaire, les objectifs et leurs caractéristiques et le type d’éclairage.
Guide de choix d’un microscope :choisir le type de microscope en fonction de la taille de l’échantillon à étudier : Microscope droit/inversé ou Stéréomicroscope,
choisir le type d’observation que l’on souhaite faire : Fond clair, Fond noir, Contraste de phase, Fluorescence, Métallographie, Polarisation,
choisir le nombre d’oculaire (et le champ) : Monoculaire, Binoculaire, Trinoculaire (pour branchement d’une caméra),
choisir les objectifs : Zoom, x2, x3, x4, x10, x20, x40, x60, x100,
choisir les caractéristiques des objectifs : Achromatiques - Semi-Apochromatique - Apochromatique, Plan - Semi-Plan, Correction à l’infini,
choisir le type d’éclairage : LED ou Halogène.
Lire la suiteUn microscope est un instrument qui permet d'obtenir une image agrandie d'objets de très petite dimension. Pour choisir un microscope, l'utilisateur doit identifier la taille de l'échantillon à étudier, déterminer le type d'observation que l'on souhaite faire, choisir le nombre d'oculaire, les objectifs et leurs caractéristiques et le type d'éclairage.
Guide de choix d'un microscope :- Choisir le type de microscope en fonction de la taille de l'échantillon à étudier : Microscope droit/inversé ou Stéréomicroscope
- Choisir le type d'observation que l'on souhaite faire : Fond clair, Fond noir, Contraste de phase, Fluorescence, Métallographie, Polarisation
- Choisir le nombre d'oculaire (et le champ) : Monoculaire, Binoculaire, Trinoculaire (pour branchement d'une caméra)
- Choisir les objectifs : Zoom, x2, x3, x4, x10, x20, x40, x60, x100
- Choisir les caractéristiques des objectifs : Achromatiques - Semi-Apochromatique - Apochromatique, Plan - Semi-Plan, Correction à l'infini
- Choisir le type d'éclairage : LED ou Halogène
Lexique :- Distance inter pupillaire : Distance entre chaque pupilles. Cette dernière est réglable sur les oculaires de la plupart des microscopes
- Parafocalité : Elément technique d'un zoom permettant de garder une netteté de l'image en augmentant ou en diminuant le zoom. Une parafocalité sur toute la plage de grossissement d'un zoom permet d'éviter une nouvelle mise au point à chaque changement de grossissement. La parafocalité sur toute une plage de zoom augmente le prix du stéréomicroscope.
- Eclairage incident : Eclairage arrivant par le dessus de l'échantillon
- Eclairage transmis : Eclairage arrivant par le dessous de l'échantillon
- Distance de travail max : Distance maximum entre un objet et le bout de la loupe pour que la vision de ce dernier soit encore net. La distance de travail peut varier si on ajoute des lentilles supplémentaires de grossissement (option comme le Nexius Zoom ou de série comme la Série DZ)
- Pouvoir séparateur : Le pouvoir de résolution, ou pouvoir de séparation, ou la résolution spatiale, est la distance ou l'angle minimal qui doit séparer deux points contigus pour qu'ils soient correctement discernés par un système de mesure ou d'observation. Plus le pouvoir séparateur est bon et meilleurs sont les détails aperçus dans l'oculaire. Inversement, moins bon est le pouvoir séparateur et plus l'image semble floue. La qualité du pouvoir séparateur fait augmenter le prix d'un microscope.
- Aberration chromatique : Une aberration chromatique est une aberration optique qui produit différentes mises au point en fonction de la longueur d'onde. On observe alors une image floue et aux contours irisés. Elle résulte de la décomposition de la lumière blanche en plusieurs bandes de couleurs. Elle est généralement due à la variation de l'indice de réfraction du matériau composant les lentilles en fonction de la longueur d'onde de la lumière qui les traverse. On parle de dispersion du verre. Il en résulte que la distance focale dépend de la longueur d'onde, de sorte que la mise au point ne peut être effectuée simultanément pour toutes les couleurs du spectre. Concrètement, lorsque que l'on se focalise sur une longueur d'onde (bleu par exemple), les autres couleurs n'apparaissent pas correctement. La correction de l'aberration consiste à avoir une distance focale identique pour chaque longueur d'onde (toutes les longueurs d'onde se croisent en un même point). La réduction de cette aberration chromatique peut s'effectuer avec l'utilisation de lentilles apochromatiques, en l'ajout de fluorine dans le verre diminuant la dispersion chromatique.
- Oculaire Grand champ : Le champ observé dépend de l'indice de champ de l'oculaire divisé par le grossissement de l'objectif. Pour un oculaire 10X/20mm avec un objectif 100X, le diamètre observé = 20 / 100 = 0,2mm. Plus le champ est grand (valeur en mm) et plus l'image est vaste. L'image paraît donc plus grande avec plus d'éléments dessus. Un oculaire grand champ est recommandé lorsque l'on souhaite non pas regarder un point dans le détail mais une surface bien plus étendue. Elle peut être également intéressante pour du comptage ou l'analyse de tendance à l'observation.
- Objectif Achromatique : Les objectifs achromatiques permettent de corriger l'aberration chromatique sur deux longueurs d'onde : le bleu et le rouge. Il corrige également l'aberration sphérique sur une longueur d'onde : le jaune-vert. La plupart des microscopes standard et entrée de gamme ont des objectifs achromatiques.
- Objectif semi-apochromatique : Les objectifs semi-aprochromatiques ou à la fluorine sont corrigés pour l'aberration chromatique et de sphéricité sur deux (ou trois) longueur d'onde.
- Objectif apochromatique : Les objectifs apochromatiques utilisent la fluorine, des verres spéciaux, un plus grand nombre de lentille, et des traitements multicouches. Ils sont corrigés sur 3 ou 4 longueurs d'onde pour l'aberration chromatique et sur deux longueurs d'onde sur l'aberration de sphéricité (bleu et rouge). Ils permettent de distinguer les plus petits détails mais leurs coûts restent assez élevés.
- Objectif semi-plan : Avec les trois objectifs ci-dessus, les courbures de champs ne sont pas éliminées. C'est-à -dire que le bord des images est flou tandis que le centre est plus net. L'objectif semi plan permet de réduire la zone de flou de 90%. C'est-à -dire que 90% de la zone centrale de l'image sera net tandis que le contour de l'image (10%) sera flou. Ce type d'objectif est bien moins cher qu'un objectif plan et permet de couvrir une grosse zone visible avec une très bonne netteté. On peu ainsi avoir un objectif semi-plan achromatique, semi-apochromatique et apochromatique.
- Objectif plan : Les courbures de champs sont totalement éliminées permettant d'avoir 100% de la zone visible complètement net. Ce type d'objectif est le plus onéreux. Cela permet d'avoir un ensemble net pour une vue globale et de pouvoir analyser des objets à la périphérie du cercle de vision.
- Distance de travail ou distance frontale : Il s'agit de la distance entre la lamelle et la lentille frontale de l'objectif. Plus l'objectif a un fort grossissement, plus la distance diminue.
- L'ouverture numérique (ON = NA Numerical aperture) : Plus un objectif est puissant et plus son ouverture numérique est grande et plus son angle de capture augmente. Plus l'angle de capture augmente et plus ils sont aptes à montrer les petits détails. Un objectif à sec a une ON qui ne dépasse pas 0.95
- Objectif à immersion : Pour augmenter la valeur de l'ON qui est de 0,95 des objectifs à sec, on peut ajouter de l‘huile pour augmenter artificiellement l'ON (en augmentant l'indice de réfraction entre la lentille et la lamelle). Cela permet ainsi d'augmenter les détails de l'image. On trouve ainsi des objectifs x100 à immersion à ON 1,25.
- Objectif corrigé à l'infini IOS : Un objectif est en quelque sorte lié à son microscope. C'est-à -dire qu'un objectif est fonction de la longueur du tube du microscope. Cela induit le fait que des objectifs ne peuvent pas forcément passer d'un microscope à un autre. On appelle cela des objectifs non corrigés à l'infini. Les nouveaux microscopes incorporent des lentilles supplémentaires dans le tube permettant d'utiliser des objectifs IOS. Ils permettent ainsi d'aller sur tout type de microscope disposant de cette technologie et d'ajouter divers équipements sur le trajet optique entre l'objectif et l'oculaire (tube trinoculaire, passeur de filtre, polariseur, prisme etc…)
- Présence d'un filtre bleu : Le filtre bleu livré très souvent de base avec les microscopes permettent de diminuer la dominante rouge des éclairages halogène. Il suffit de le placer au dessus de la lentille de champ ou avant l'entrée dans le condenseur.
- Condenseur d'Abbe : Le condenseur d'Abbe a généralement une ouverture optique de 1,25. Il ne nécessite pas une goutte d'huile sur sa lentille supérieure lorsqu'il faut utiliser un objectif avec une ON > 1 (100x à immersion par exemple). Il permet l'utilisation d'objectifs allant de 4x à 100x. Normalement, un microscope dispose d'un condenseur basé sur son objectif le plus puissant. Il faudrait donc changer de condenseur pour chaque objectif. Le condenseur d'Abbe permet de modifier l'ouverture optique de ce dernier pour l'adapter à chaque objectif utilisé. Il faut donc bien choisir son condenseur en fonction de l'ouverture numérique que l'on souhaite. Si on a un objectif avec une ON de 0,65, il faut régler le condenseur à 0,65.
- Condenseur d'Abbe de Zernike : Il s'agit tout simplement d'un condenseur d'Abbe utilisant le contraste de phase.
- Eclairage de Kà¶lher : Les propriétés les plus importantes d'un bon éclairage sont : Uniformité de l'éclairage, Limitation de la zone éclairée au champ vu dans le microscope et Contrôle de l'ouverture numérique de l'éclairage. L'objectif de l'éclairage de Kà¶lher est d'utiliser un diaphragme d'ouverture afin de faire varier la lumière pour augmenter la qualité de l'image fournissant à la fois une bonne résolution et un bon contraste. Normalement, un réglage n'est valable que pour un objectif (le réglage devant être refait à chaque changement d'objectif).
- Diaphragme de champ : Le diaphragme de champ souvent situé sur le microscope permet de régler et de bien positionner le condenseur. Pour cela, il faut dans un premier temps fermer à moitié le diaphragme de champ pour le rendre visuellement le plus net possible. Dans un second temps, il faut le centrer vis-à -vis de ce que vous voyez dans le microscope. Il permet ainsi de bien positionner horizontalement et verticalement le condenseur et d'avoir un éclairage des plus efficaces. Le diaphragme de champ faisant partie du réglage de Kà¶lher a ainsi pour objectif de centrer tous les éléments. Enfin, il faut ouvrir le diaphragme de façon à avoir juste le cercle lumineux visualiser dans les oculaires (Diminue les interférences lumineuses au delà du cercle.
- Microscope à fond noir : Le microscope à fond noir (ou en champ sombre) permet d'améliorer le contraste d'échantillons qui sont à priori transparents et difficilement observables au microscope optique classique. La lumière source (transmise) n'atteint pas directement l'objectif ; seule la lumière diffusée et donc déviée par l'échantillon peut être observée. Le contraste est ainsi fortement amélioré, sans nécessiter la coloration d'un échantillon pourtant transparent. La préparation des échantillons est donc peu contraignante, mais cet avantage est contrebalancé par la faible intensité lumineuse perçue par l'observateur. La microscopie à fond noir est adaptée aux échantillons non colorés. Elle permet d'observer des structures vivantes et en déplacement comme des bactéries ou des organismes unicellulaires.
- Un microscope à contraste de phase (ou en contraste de phase) est un microscope optique qui transforme en niveaux de contraste les différences d'indices de réfraction entre deux structures, lesquelles se traduisent en différences de phase pour les ondes lumineuses les traversant. Il visualise ainsi des structures transparentes quand leur indice de réfraction diffère de celui de leur voisinage. Dans un tel microscope, deux dispositifs, appelés anneaux de phase, sont placés l'un dans le condensateur (le système optique qui focalise la lumière sur l'objet) et l'autre dans l'objectif. Quand le bord d'une structure produit une diffraction suffisante, la lumière qui le traverse subit un déphasage par rapport aux autres rayons lumineux. Les anneaux filtrent ces rayons déphasés et il en résulte sur l'image un contraste accentué de la structure. Imaginé en 1930 par le Hollandais Frits Zernike (1888-1966), il a valu à son concepteur le prix Nobel de physique en 1953. Ce microscope permet d'étudier des cellules vivantes, sans devoir leur infliger une coloration. Le microscope à contraste de phase produit un halo autour des structures observées, ce que ne fait pas le microscope à contraste interférentiel.
- Microscope polarisant : Le microscope en lumière polarisée est un microscope optique dont la technologie repose sur l'utilisation d'un faisceau de lumière polarisée (des ondes vibrant dans un seul plan). Pour assurer la polarisation de la lumière, un polarisateur est placé après la source de lumière, avant l'échantillon. Le deuxième polarisateur, appelé l'analyseur, est placé perpendiculairement au premier et ne peut donc pas laisser passer la lumière premièrement polarisée. Par contre, un échantillon placé entre les deux polarisateurs perturbe le faisceau lumineux qui va adopter de nouvelles vibrations dont certaines vont pouvoir traverser l'analyseur. Suivant la particularité de la lumière reçue, il est possible de déterminer la composition de l'échantillon observé. Le microscope en lumière polarisée permet d'observer et d'identifier des minéraux de roche. La préparation du minéral consiste en la section d'une tranche fine et d'un polissage pour atteindre une épaisseur d'environ 30 micromètres. Le microscope polarisant est donc un microscope optique équipé de : 2 filtres polarisants (Le polariseur et l'analyseur), 1 platine tournante centrée sur l'axe optique. Le premier filtre appelé polariseur est fixe. Son plan de vibration est confondu avec le plan symétrique du microscope et matérialisé dans le champ de l'oculaire, par le fil nord-sud du réticule. Le second filtre est appelé l'analyseur, il a son plan de vibration perpendiculaire à celui du polariseur et matérialisé par le fil est-ouest du réticule. Il est mobile et permet deux modes d'observation.
Pour tout renseignement complémentaire, contactez-nous sur www.labomoderne.com ou au 01.42.50.50.50.Concept de Biréfringence : La lumière ordinaire (naturelle ou artificielle) est une onde électromagnétique qui vibre dans toutes les directions dans un plan perpendiculaire au trajet de propagation. Lorsque cette lumière traverse un filtre particulier — filtre polarisant — elle ne vibre que dans une seule direction, cette lumière est appelée lumière polarisée.
Dans la plupart des minéraux, suivant la direction de polarisation, la lumière n'aura pas la même vitesse. Lorsqu'un rayon lumineux pénètre dans un cristal, il se dédouble en deux rayons de polarisation différente qui se propagent avec une vitesse différente, c'est la biréfringence. On peut aussi décrire ce phénomène comme une rotation de la polarisation. Le filtre analyseur placé après l'échantillon sélectionne à nouveau les rayons lumineux selon leur polarisation, ainsi, selon la quantité dont a tourné la polarisation (donc selon la nature des cristaux), ceux-ci apparaissent plus ou moins lumineux, voire de couleurs différentes. Certains cristaux sont quasiment isotropes et ne provoquent pas de biréfringence (notamment les cristaux cubiques), et peuvent être facilement distingués des cristaux anisotropes.
On peut ainsi utiliser deux modes d'observation.
LPNA : Lumière polarisée non analysée dite lumière naturelle (polarisateur en place et analyseur escamoté) pour : la forme de minéraux, la couleur, le pléochroïsme, les clivages, le relief, l'altération
LPA : Lumière polarisée dite lumière polarisée (polarisateur et analyseur en place) pour : la teinte de polarisation, la position d'extinction, la présence de macles
Ce type de microscope est utilisé pour :
- - Etude des roches et minéraux
- - Etude des matériaux céramiques, polymères
- - Analyse d'urine et examen amyloïdes
- - Observation de dents et os
- - Observation de tissus musculaires striées et nerveux
- - Défauts dans les cristaux
- - Analyse de cristaux (farine, sucre etc.)
Analyseur et polariseur perpendiculaire, une coupe de roche est placée entre les deux éléments.
Alors que la lumière ne devrait pas passer, l'échantillon vient modifier les propriétés de la lumière dans le plan dans lequel elle se propage. Chaque cristal composant l'échantillon va modifier la lumière donnant ainsi une teinte colorée à la sortie de l'analyseur. Il suffit ensuite de modifier l'angle de la platine tournante pour faire varier les couleurs et les observations de la coupe.
La métallographie est la technique consistant à déterminer la structure d'un métal en l'observant avec un microscope optique. On peut déterminer ainsi, selon les cas :
- la taille et la forme des cristallites (ou grains) ;
- la répartition des phases ;
- la direction des lignes de glissement (intersection des plans de glissement avec la surface), dans le cas d'un échantillon déformé (voir les articles sur la déformation plastique et la dislocation)
Contrairement à la microscopie classique, l'échantillon n'est pas en couche mince au travers de laquelle les rayons lumineux peuvent passer, mais ces rayons, provenant de l'objectif même du microscope, sont réfléchis par la surface polie de l'échantillon à examiner, et traversent une seconde fois l'objectif dans l'autre sens pour pouvoir, ensuite, être observés par l'oculaire
On peut utiliser des atlas métallographiques de référence pour caractériser la pièce à contrôler par rapport à des images types.
Microscope inversé : à€ l'inverse de la microscopie optique classique o๠la lumière arrive sur l'échantillon par le bas et o๠l'observation se fait par le dessus, pour le microscope inversé la source de lumière est placée au-dessus de l'échantillon et les objectifs en dessous. Cette configuration non-standard d'observation peut être adaptée à toutes les méthodes de microscopie (fluorescence, contraste de phase…). Ce microscope est beaucoup utilisé pour l'observation de cellules en culture in vitro, mais peut l'être en général pour observer des objets épais ou situés sur le fond de boîtes de pétri.
Principe de fonctionnement d'un microscope à fluorescence : La fluorescence est la propriété que certains corps ou molécules ont à émettre une lumière après avoir été excités avec une lumière d'énergie supérieure. Ainsi, un objet excité par une longueur d'onde émettra une fluorescence à une longueur d'onde supérieure. La technique du microscope en fluorescence est donc la même qu'un microscope optique, sauf que la lumière utilisée n'est pas blanche, mais possède une gamme définie de longueur d'onde. Toutefois, en général, la lumière arrive sur l'échantillon par le haut (épi-fluorescence) et non par-dessous. à€ l'émission, on peut alors utiliser des lasers possédant une longueur d'onde unique ou des filtres d'excitation ne laissant passer que la lumière de longueur d'onde désirée sur l'échantillon. Après excitation de l'échantillon, celui-ci émet à son tour une lumière d'une longueur d'onde différente. On peut utiliser des filtres permettant de n'observer que la longueur d'onde désirée, c'est-à -dire les photons d'émission, et bloquer les photons d'excitation. Le microscope en fluorescence permet de visualiser des objets qui sont naturellement fluorescents (chlorophylle...), ou des molécules rendues fluorescentes pour mieux les observer (protéines couplées à la GFP, DAPI pour l'ADN, fluorochromes).
Des techniques utilisant cette microscopie ont été développées :
- - immunofluorescence (marquage à l'aide d'un anticorps couplé à un fluorochrome) ;
- - FISH ou hybridation fluorescente in situ pour marquer des séquences nucléotidiques grâce à des oligonucléotides couplés à des fluorochromes ;
- - FRET ou transfert d'énergie entre molécules fluorescentes permet de visualiser si deux molécules interagissent ;
- - BIFC ou complémentation de fluorescence bimoléculaire permet de visualiser une interaction en reconstituant l'intégrité d'un fluorochrome à l'aide de deux molécules...
Concept de la fluorescence : Le but de la fluorescence est de mettre en évidence une molécule particulière que l'on veut étudier (ADN, ARN, ATP etc…). Pour faire simple, on marque la molécule avec une autre molécule qui vient s'attacher sur cette dernière. Cette molécule dite fluorescente (fluorophore ou fluorochrome) possède la propriété d'absorber de l'énergie lumineuse (longueur d'onde d'excitation) et de la restituer rapidement (longueur d'onde d'émission) sous forme de lumière fluorescente. La molécule va donc, via l'excitation, emmagasiner de l'énergie qu'elle va tout de suite libérer sous forme d'émission. Une molécule répond à une longueur d'onde d'excitation spécifique.
Par exemple :
- le DAPI a une longueur d'onde d'excitation à 310 nm et d'émission à 450-490 nm (Fluorescence bleue)
- La GFP a une longueur d'onde d'excitation à 395 nm et d'émission à 508 nm (Fluorescence verte)
- Le BET est excité par la lumière UV et émet dans le rouge
Il existe ainsi des « cubes » qui sont simplement l'association d'un filtre d'excitation (choix de la longueur d'onde d'excitation), d'un miroir dichroïque et d'un filtre d'émission (choix de la longueur d'onde d'émission vers les oculaires). Il est ainsi possible de mettre plusieurs cubes sur un même microscope sur un passeur afin de glisser d'une longueur d'excitation à une autre. Il n'est par contre pas possible de visualiser trois longueurs d'onde en même temps (il faut alors prendre 3 images à chaque longueur d'onde puis les superposer via un logiciel adapté).
Il faut ainsi choisir son cube en fonction des fluorochromes utilisés (molécules fluorescentes). Ci-dessous, le schéma simplifié d'un cube.
L'épi-fluorescence : Le principe de l'épi-fluoresence reste simple et est maintenant très rependu dans le monde de la microscopie. Une source de lumière (Xénon, lampe à mercure, Led etc…) envoie un spectre lumineux restreint sur le filtre d'excitation. En ressort ainsi une longueur d'onde précise (monochrome) qui traverse la lentille de l'objectif (traitée spécialement avec de la fluorine), excite les fluorochromes qui renvoient une longueur d'onde bien spécifique. Cette dernière revient dans l'objectif, passe à travers le miroir dichroïque et traverse le filtre d'émission afin de filtrer précisément une seule longueur d'onde souhaitée.
Pour tout renseignement complémentaire, contactez-nous sur www.labomoderne.com ou au 01.42.50.50.50.